基因步移（genomic walking）實驗

基步移(genomic walking)實驗用以鑒定已經(jīng)克隆的特定DNA片段側翼順序的方法。肥經(jīng)被鑒腚
的特定DNA片段一端或兩端的末端片段為探針去篩選基因組DNA文庫, DNA-端或兩端并與之重疊的克隆
進行篩選與定。然后用新鑒定克隆中與原始克隆DNA非共有的一端的片股作探針，進行新的篩選與鑒
定。依次類推，可以弄清跨度為幾百個kb的連接片段。基銦組步移分為基因組結合文庫的染色體步移技術
和基于PCR擴增的技術。

TAIL-PCR法可用于基因步移研究。該技術通過3個嵌套的特異性弓|物分別和簡并弓|物組合進行連續(xù)的
PCR循環(huán)，利用不同的退火溫度選擇性地擴增目標片段,所獲得的片段可以直接用做探針標記和測序模
板。該技術省去了諸如:酶切、連接、加尾等傳統(tǒng)的基因克隆步驟,且克服了常規(guī)PCR不能對已知DNA
列側翼的位置序列進行擴增的缺點，能快速地分離到目標序列。具有:操作簡便成本低、高特異
性、高靈敏性、快速等優(yōu)點。
TAIL-PCR一般分為三輪PCR反應。第一輪PCR反應 (如圖1) 由伍次高退火溫度(一 般65°C)的特異
性反應、-次極低退火溫度(一 般25°C)的低特異性反應，與由二個腿火溫度(一 般65°C)的高特異性
反應與一個低退火溫度(一 般44°C) 的低特異性反應所組成的15個熱不對稱的超級循環(huán)構成。通過五次高
特異性的反應，使spI與已知的序列(載體或T-DNA等)退火并延伸,提高目標序列的濃度。一次低特異性的
反應使簡粥|物結合到較多的目標序列上，隨后進行15次熱不對稱的超級循環(huán)。經(jīng)過上述反應得到了不同
濃度的三種類型的產(chǎn)物:由特異性弓|物和簡并弓|物擴增出的特異性產(chǎn)物和由同一簡并引|物或特異引|物擴增
得到的非特異性產(chǎn)物。第二輪PCR反應(如圖2)則將第一級反應的產(chǎn)物稀釋1000倍作為模板，通過15次
熱不對稱的超級循環(huán)，使特異性的產(chǎn)物被選擇性地擴增,腓特異性的產(chǎn)物被壓制到極低的含量。第三輪
PCR反應(如圖3) 又將第二輪PCR反應的產(chǎn)物稀釋1000倍作為模板，-般設置為普通的PCR反應或熱不
對稱的超級循環(huán)。通過上述三輪PCR反應可獲得與已知序列鄰近的目標序列。