DNA/基因合成與純化

現(xiàn)如今固相亞磷酰胺三酯法是普遍采用的DNA合成方法，具有高效，快速偶聯(lián)的優(yōu)點。其基本原理是：將核苷酸單體按照3′→5′磷酸二酯鍵鏈接，使其具有天然DNA分子的全部生物學(xué)活性和排列順序。同時，合成過程中將暫時不需要的基團保護起來以防止活躍基團發(fā)生連接反應(yīng)生成副產(chǎn)物，且在下一輪縮合反應(yīng)之前去除保護基以保證不斷形成專一的3′→5′核苷酸排列。

首先將欲合成的寡核苷酸鏈3′末端核苷(N1)以其3′OH通過1個長的烷基臂與固相載體保護。然后從N1開始逐步地接長寡核苷酸酸鏈：

1.        去保護：以苯磺酸(或三氯醋酸)處理帶有保護基的核苷，去除5′末端的DMTr，暴露出5′OH，經(jīng)洗滌后進行下步反應(yīng)。

2.        耦聯(lián)反應(yīng)：加入經(jīng)四唑激活的核苷N2，使之與核苷N1上的5′OH起耦聯(lián)反應(yīng)，乙腈洗滌。

3.        加帽反應(yīng)：加入醋酐及二甲基氨基吡啶，使未參加反應(yīng)的寡核苷酸鏈(2%以下)乙酰化，乙酰化的鏈不參加下一步反應(yīng)，如此有利于純化所需全長的DNA的片段。

4.        氧化反應(yīng)：加入碘，使三價的亞磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的五價磷酸。

上述循環(huán)完成之后進行第二個合成循環(huán)。每經(jīng)歷一輪循環(huán)，接長1個核苷酸。接長的鏈始終被固定在不溶的固相載體上，過量的未反應(yīng)物或分解物則通過過濾或洗滌除去。當整個鏈達到預(yù)定的長度后，從固相載體上切下，氨解法脫去保護基，并經(jīng)過分離純化得到所需要析后產(chǎn)物。 

DNA的純化常采用丙烯酰胺凝膠電泳純法，具體操作如下：

1.        從合成柱上洗脫的寡核苷酸片段，冰凍、干燥、去氨水，溶于適量水中后，占樣于15～20%丙烯酰胺凝膠制備膠上，按10V/cm條件電泳，過夜。

2.        電泳完畢后，取下凝膠于EB染色后觀察，或直接將含寡核苷酸片段的凝膠置于硅膠熒光板上(CMC板)紫外線燈下，根據(jù)分子量的標準切下所需的區(qū)段(呈黑色)，將膠塊置少量緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA 300mmol/L NaCl)，搗碎膠塊，25～42℃浸泡過夜(4～24小時)，或?qū)⒛z塊置于有少量緩沖液的透析袋中，通電下，寡核苷酸片段即進入透折袋中。

3.        洗脫的寡苷酸核片段以酒精沉淀、洗滌，真空抽干后即可應(yīng)用。

服務(wù)流程如下

1.        序列評定

2.        片段拼接

3.        克隆

4.        篩選

5.        核對測序結(jié)果

6.        凍干粉質(zhì)粒