親和力成熟

親和力成熟是改善抗體和抗原親和力的過程。異源抗體在人源化的過程中往往伴隨著親和力的下降，體外親合力成熟的過程包含了引入突變和生物淘選的過程。

艾柏森生物擁有豐富的抗體親和力成熟經(jīng)驗(yàn)，我們通常以scFV形式進(jìn)行抗體親和力成熟改造，同時(shí)我們也提供單域抗體的親和力成熟服務(wù)。通過隨機(jī)突變、定位突變等多種突變方式，結(jié)合專有人類抗體數(shù)據(jù)庫、電子建模等技術(shù)進(jìn)行抗體親和力成熟優(yōu)化。利用整合數(shù)據(jù)庫中針對(duì)特異抗原的篩選技術(shù)，艾柏森生物提供的抗體親和力成熟服務(wù)可以將scFV抗體的KD提高至10-8-10-9，甚至艾柏森生物曾成功的獲取KD為10-12的scFV抗體。

服務(wù)流程

設(shè)計(jì)親和力成熟方案

目前主要采用以下幾種方式：點(diǎn)突變（定點(diǎn)突變和隨機(jī)誘變）、CDR區(qū)重組、鏈替換以及DNA重組等手段。艾柏森生物提供基于抗原-抗體相互作用的結(jié)構(gòu)信息開展體外親和力成熟技術(shù)，通過計(jì)算機(jī)輔助分子模擬確定氨基酸被取代的可能性，預(yù)測(cè)出氨基酸被取代后產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化以及如何影響其與靶抗原的結(jié)合，并通過噬菌體展示或細(xì)胞表面展示技術(shù)篩選出具有高親和力的抗體。

1. 設(shè)計(jì)scFV突變文庫

a. 隨機(jī)突變法

一般采用易錯(cuò)PCR法在整個(gè)VH和VL區(qū)引入隨機(jī)突變。艾柏森生物的突變菌株CD-affiTM能大大增加抗體庫基因的多樣性。同時(shí)也可以采用鏈替換的方法引入突變。

b. 寡核苷酸定點(diǎn)突變法

當(dāng)抗體/抗原復(fù)合物結(jié)構(gòu)可知或者可以通過計(jì)算機(jī)技術(shù)模擬時(shí)采用。

2. 建立噬菌體展示突變庫

2.1將全套scFV基因片段連接至pCANTAB5e載體，隨后電轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1；同時(shí)鑒定ScFv基因庫庫容（及基因的插入率）。

2.2將輔助噬菌體M13K07加入到轉(zhuǎn)入了ScFv抗體基因的，生長至對(duì)數(shù)生長期的大腸桿菌中進(jìn)行噬菌粒拯救。

2.3培養(yǎng)過夜后，離心收集上清即獲得噬菌體ScFv抗體庫，并對(duì)抗體庫的滴度進(jìn)行測(cè)定。

3. 噬菌體展示突變抗體庫篩選

采用兩種純抗原篩選方式：固相篩選法和液相篩選法經(jīng)過4輪的淘洗，一般情況下抗體的親和力可以達(dá)到10-8以上。流程示意圖見下圖。

4. ELISA比較噬菌體展示的人源化scFV和親本鼠scFV的親和力

噬菌體擴(kuò)增— ELISA檢測(cè)—噬菌體DNA提取—噬菌體DNA測(cè)序

5. 人源化scFV的ELISA驗(yàn)證

從以上已測(cè)序的結(jié)合噬菌體中，挑取5-10株不同序列的噬菌體進(jìn)行抗體的可溶性表達(dá)，并進(jìn)行ELISA鑒定。

6. 測(cè)序

對(duì)親和力較好的scFV進(jìn)行基因測(cè)序，排除FR區(qū)包含大量非人源序列的突變體。

7. 親和力測(cè)定

艾柏森生物采用BIAcore system和ForteBio Octet平臺(tái)，能高效、準(zhǔn)確的測(cè)定抗體的親和力。 ForteBio還可以用于過程中定量分析、抗體篩選以及細(xì)胞系優(yōu)化、抗原表位定位、抗體配對(duì)等。挑選3-5株克隆，測(cè)定抗體和抗原的親和力。

8. 構(gòu)建人源化IgG抗體

將人源化scFV抗體的VH和VL通過基因工程的手段分別插入帶有人Fc片段基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，表達(dá)全長抗體，并進(jìn)行親和力測(cè)定。