酵母蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素解讀

　　酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)以甲醇畢赤酵母為代表，具有表達(dá)量高，可誘導(dǎo)，糖基化機(jī)制接近高等真核生物，分泌蛋白易純化，易實(shí)現(xiàn)高密發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)為部分蛋白產(chǎn)物易降解，表達(dá)量不可控。

　　酵母蛋白表達(dá)的幾大關(guān)鍵因素：

　　1.表達(dá)載體

　　首先，甲醇酵母中沒(méi)有穩(wěn)定的質(zhì)粒，所以其表達(dá)載體采用整合型質(zhì)粒。利用醇氧化酶基因-1(AOX1)的啟動(dòng)子(PAOX1)和轉(zhuǎn)錄終止子(3′AOX1)構(gòu)建成整合型表達(dá)載體。PAOX1是一個(gè)*的啟動(dòng)子，醇氧化酶的產(chǎn)量高可占甲醇酵母中可溶性蛋白質(zhì)的30%，所以能使外源蛋白質(zhì)在它的控制下高效產(chǎn)生。其次，在載體中加入釀酒酵母的分泌信號(hào)和前導(dǎo)肽序列(α因子)構(gòu)建分泌型載體，一方面可以減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷，另一方面可以減少宿主細(xì)胞蛋白水解酶對(duì)外源蛋白質(zhì)的降解，pPIC9K、pMETαA、B、C均為此類(lèi)載體。此外，使多拷貝目的基因整合入甲醇酵母染色體，形成多個(gè)表達(dá)單元，產(chǎn)生高產(chǎn)的菌株，此類(lèi)載體有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。

　　2.受體菌

　　在以葡萄糖或甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，甲醇酵母中AOX1基因的表達(dá)受到抑制，而在以甲醇為單獨(dú)碳源時(shí)，誘導(dǎo)基因表達(dá)，使外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量更高。甲醇酵母適合高密度連續(xù)培養(yǎng)的條件，細(xì)胞干重達(dá)100g/L以上，蛋白質(zhì)產(chǎn)量*。受體菌采用蛋白水解酶缺陷型，從而大大降低產(chǎn)物的降解。常用的甲醇酵母受體菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。