蛋白質純化技術指南

蛋白質是包括人類在內的各種生物有機體的重要組成成分，是生命物質基礎之一。生物體的生長、發育、遺傳和繁殖等一切生命活動都離不開蛋白質。

隨著分子生物學、結構生物學、基因組學等研究的不斷深入，人們意識到僅僅依靠基因組的序列分析來試圖闡明生命活動的現象和本質是遠遠不夠的。只有從蛋白質組學的角度對所有蛋白質的總和進行研究，才能更科學地掌握生命現象和活動規律，更完善地揭示生命的本質。

蛋白質的分離純化是生物化學研究應用一項重要技術。蛋白純化是一項復雜的過程，包括粗分離，初步純化和精細純化等多個步驟。利用不同蛋白間內在的差異如大小，形狀，電荷，疏水性，溶解度和生物學活性，將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。實驗方法包括抽提，沉淀，離心，層析等多種手段。

蛋白質的分離純化在生物化學研究應用中使用廣泛，是一項重要的操作技術。 一個典型的真核細胞可以包含數以千計的不同蛋白質，一些含量十分豐富，一些僅含有幾個拷貝。為了研究某一個蛋白質，必須首先將該蛋白質從其他蛋白質和非蛋白質分子中純化出來。

蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細純化階段二個階段。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細胞成分如DNA,RNA等分開，由于此時樣本體積大、成分雜、要求所用的數脂高容量、高流速、顆粒大、粒徑分布寬。并可以迅速將蛋白與污染物分開，防止目的蛋白被降解。精細純化階段就需要更高的分辨率此階段是要把目的蛋白與那些大小及理化性質接近的蛋白區分開來，要用更小的樹脂顆粒以提高分辨常用的離子交換柱和疏水柱，應用時要綜合考慮樹脂的選擇性和柱效兩個因素。選擇性指樹脂與目的蛋白結合的特異性，柱效則是指蛋白的各成分逐個從樹脂上集中洗脫的能力，洗脫峰越窄，柱效越好。僅有好的選擇性，洗脫峰太寬，蛋白照樣不能有效分離。

蛋白沉淀蛋白能溶于水是因為其表面有親水性氨基酸在蛋白質的等電點處若溶液的離子強度特別高或特別低，蛋白則傾向于從溶液中析出。硫酸銨是沉淀蛋白質最常見的鹽，因為它在冷的緩沖液中溶解性好有利于保護蛋白活性。硫酸銨分餾常用做純化的第一步，它可以初提蛋白質，去除非蛋白成分。而且蛋白質在硫酸銨沉淀中比較穩定。可以短期保存中間產物，當前蛋白質純化多采用這種辦法進行粗分離翻。除了鹽析外蛋白還可以用多聚物如PEG和防凍劑沉淀出來，PEG是一種惰性物質，同硫酸銨一樣對蛋白有穩定效果，在緩慢攪拌下逐漸提高冷的蛋白溶液中的PEG濃度，蛋白沉淀可通過離心或過濾獲得，蛋白可在這種狀態下長期保存而不損壞。其好處是可以把蛋白從混雜有蛋白酶和其他有害雜質的培養基及細胞裂解物中解脫出來。

蛋白質分離純化的一般程序可分為材料的預處理及細胞破碎，機械破碎法，滲透破碎法，反復凍融法，超聲波法，酶法。無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基費磷酸（DFP）可以抑制或減慢自融作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白質水解酶的活性，加入苯甲磺酰砩化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可以通過選擇PH，溫度或離子強度等，使這些條件都要適用于目的物質的提取。

通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100 等），使膜結構破壞，利于蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。選用適當的方法將所要的蛋白質與其他雜質蛋白分離開來。比較方便有效方法根據蛋白溶解度的差異進行分離。常用的方法有：等電點沉淀法、鹽析法、有機溶劑沉淀法。