細(xì)胞衰老檢測(cè)方法與步驟

細(xì)胞衰老是細(xì)胞在正常環(huán)境條件下發(fā)生的功能減退、逐漸趨向死亡的現(xiàn)象。zhong所周知，衰老的細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞體積變大，呈扁平狀；細(xì)胞核變大，核膜內(nèi)陷，染色質(zhì)聚集、固縮、裂解；胞質(zhì)內(nèi)顆粒增加，有空泡形成；線粒體的數(shù)目及形狀發(fā)生改變；膜流動(dòng)性降低；溶酶體內(nèi)容物增多，導(dǎo)致溶酶體酶β-半乳糖苷酶活性升高。衰老細(xì)胞所具有的上述特征成為各種細(xì)胞衰老檢測(cè)手段的依據(jù)。

其中，對(duì)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的檢測(cè)是有效檢測(cè)細(xì)胞衰老的經(jīng)典方法。X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）是β-半乳糖苷酶的底物，X-Gal本身無(wú)色，經(jīng)β-半乳糖苷酶水解后產(chǎn)生半乳糖和藍(lán)色的5-溴-4-氯-靛藍(lán)。利用X-Gal的這個(gè)特點(diǎn)，可以間接對(duì)β-半乳糖苷酶的活性進(jìn)行測(cè)定。衰老細(xì)胞中的溶酶體內(nèi)容物通常增多，使得溶酶體酶β-半乳糖苷酶的活性升高，故可以X-Gal作為底物對(duì)細(xì)胞衰老的情況進(jìn)行檢測(cè)。

細(xì)胞衰老檢測(cè)方法與步驟

（1）細(xì)胞接種前在6孔培養(yǎng)板中預(yù)先放置滅菌的細(xì)胞片，每孔加入1×10E5個(gè)細(xì)胞，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞在細(xì)胞片上生長(zhǎng)。

（2）在超凈工作臺(tái)中吸棄6孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，加入×1 PBS，洗滌細(xì)胞1次，隨后加入2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，室溫條件下固定3~5分鐘。

（3）吸棄2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，加入×1 PBS，洗滌細(xì)胞3次，每次3分鐘。

（4）吸棄×1 PBS，加X-Gal溶液以浸沒細(xì)胞片為宜，37℃孵育4~8小時(shí)或過(guò)夜，用保鮮膜包被6孔培養(yǎng)板以防染液蒸發(fā)。

（5）取出細(xì)胞爬片，去離子水沖洗2次，再次用固定液固定4分鐘，流水輕輕沖洗。

（6）將細(xì)胞爬片按此順序脫水、透明∶95%酒精I(xiàn)（2分鐘）→95%酒精Ⅱ（2分鐘）→100%酒精I(xiàn)（2分鐘）→100%酒精I(xiàn)（5分鐘）→二甲苯I（2分鐘）→二甲苯Ⅱ（2分鐘）。

（7）中性樹膠封片。

（8）在普通光學(xué)顯微鏡下觀察衰老細(xì)胞形態(tài)。

每張片子鏡下計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞，確定X-Gal染色陽(yáng)性細(xì)胞（衰老細(xì)胞）在細(xì)胞群體中的所占的百分比即衰老細(xì)胞率（藍(lán)染細(xì)胞數(shù)/總計(jì)細(xì)胞數(shù)×100%）。

細(xì)胞衰老檢測(cè)注意事項(xiàng)

①X-Gal溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配。

②細(xì)胞固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或固定之后清洗不干凈，均會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)。