【干貨分享】細胞轉染攻略

轉染（Transfection） ，是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。

轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。

一

轉染的類型

1）根據導入的核酸存在于宿主細胞的時間長短，可以分為瞬轉和穩轉。

2）根據轉染方式可以分為化學，生物，物理方法。

脂質體轉染法簡單快捷且不需要其他儀器輔助的綜合考慮，一般是實驗室的常客，所以接下來先給大家介紹細胞轉染常用的方法-脂質體轉染的原理和操作步驟。

二

脂質體轉染法

脂質體(Liposome)轉染方法原理

脂質體作為體內和體外輸送載體的工具，已經研究的十分廣泛，中性脂質體是利用脂質膜包裹DNA，借助脂質膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽離子脂質體，DNA并沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA-陽離子脂質體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經過內吞被導入細胞。

優點:

與其它方法相比，有較高的效率和較好的重復性，它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前條件下zui方便的轉染方法之一。

脂質體轉染操作步驟

進行實驗之前，請先規劃好實驗，一般細胞轉染需要24h-72h，所以要充分了解細胞生長速度，計算所需脂質體和DNA的儲備量，并確認準備好所需試劑：Opti-MEM無血清培養基，Lipofectamine轉染試劑，以及DNA，這個一定要確認好。

1、細胞鋪板

（1）一般會選擇復蘇細胞傳代3-4次（匯合率達到90%之前對細胞進行傳代，不要長到100%），從解凍過程中恢復過來可以穩定生長的細胞進行細胞轉染，傳代次數高(>30-40)時，細胞的生長速度和形態會改變。

（2）如果提總蛋白，一般選擇六孔板進行轉染，因為轉染的細胞提取蛋白的總量能達到200ug，一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對比較少。

（3）傳代條件取決于所用的細胞系。對于快速生長的細胞，倍增時間為16小時(如HEK293)。對于生長緩慢的細胞，倍增時間為36小時(如原代細胞)。

（4）轉染當天，將細胞鋪板。如果在轉染前一天或更早時間鋪板，轉染效率可能下降，如果是簡單細胞系的轉染，可以直接在前一天晚上鋪板，第二天來轉染。轉染時，細胞密度會影響轉染效率，細胞密度保持在匯合率為70-90%（這個前提是轉染24h，如果轉染48h則需要匯合率為50-70%），細胞的鋪板和轉染也可同時進行。

2、細胞轉染

吸去培養皿中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。更換無血清培養基。準備轉染制備液，用滅菌后的EP管制備。以六孔板為例，A液：用200μl Opti-MEM稀釋4μg質粒；B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000，分別將A液、B液輕輕混勻，靜置5min，吸取B液加入至A液中，輕輕混勻，室溫靜置20min。加入轉染試劑到每個孔的培養基中，6h后，更換成*培養基，繼續培養到24-48小時（不同的質粒和脂質體最佳搭配比例不同，轉染前，應該摸一個最佳配比。質粒：脂質體=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例來檢測最佳轉染比例，一般質粒有帶熒光，可以通過觀察每組熒光強弱來判斷轉染效率）。以下為不同規格的培養板需要加DNA和lipo2000的量。

轉染時，應使用優質質粒：

1、通過測量OD 值來確定DNA純度和濃度，測得的OD值應介于1.7-1.9之間。脂質體轉染基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成及轉染的進行。

2、含有內毒素的質粒對細胞有很大的毒性作用。

轉染時，小心輕柔的將lipo2000加到培養基中并輕輕混勻，避免粗暴用力吹打，會導致脂質體失效。

血清一度曾被認為會降低轉染效率，老一代的轉染方法往往要求轉染前后用PBS洗細胞然后在無血清培養基條件下轉染，但有些對此敏感的細胞會受到損傷，甚至死亡（比如貼壁較差的細胞，在PBS洗滌時很容易沖刷細胞）導致轉染效率極低。不過轉染產品配方幾經革新后的今天，對于主流的轉染試劑來說，血清的存在已經不會影響轉染效率，甚至還有助于提高轉染效率，但是血清的存在會影響DNA-轉染復合物的形成，在DNA-轉染復合物形成時需用無血清培養基opti-MEM來稀釋DNA和轉染試劑，在轉染過程中是可以使用血清的。轉染后6小時更換培養基，因為lipo2000具有一定毒性。

細胞培養過程中往往會添加抗生素來預防污染，但是抗生素可能對轉染造成困擾。比如青霉素和鏈霉素，青鏈霉素是我們常用來預防污染的抗生素，就會影響轉染，雖然這些抗生素一般情況下對于真核細胞無毒，但當轉染試劑增加了細胞的通透性時，就會使抗生素也進入細胞從而間接導致細胞死亡，造成轉染效率低。目前轉染試劑有些已經可以全程都用有血清和抗生素的*培養基來操作，非常方便，省去了污染等麻煩。

3、觀察轉染的效果

在轉染后24小時，用熒光顯微鏡觀察實驗結果并記錄熒光蛋白表達情況，如下圖所示，說明轉染成功，且轉染效率還可以，如果不帶有熒光，可以用GFP來對照，可以放在一個單獨的孔中，或是與目標質粒共轉染，同時用Q-PCR和者WB來檢測。

轉染后發現轉染效率不高，可以通過兩種方法：

1、復轉染，即轉染后12-24小時再次進行轉染，前提是該細胞對脂質體的耐受性較好，轉染后細胞死亡數較少。

2、通過藥篩來殺死未轉入成功的細胞。前提是該質粒帶有抗生素抗性的基因。

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