百花齊放的單細(xì)胞分析技術(shù)

世界上沒(méi)有*相同的兩片樹(shù)葉，世界上也沒(méi)有兩個(gè)相同的細(xì)胞，單個(gè)細(xì)胞都是dute的，它們?cè)诖笮　⒌鞍踪|(zhì)水平和所表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄子方面都可能相差甚遠(yuǎn)。單細(xì)胞分析（Single Cell Analysis ，SCA）即是對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行研究，研究單個(gè)細(xì)胞不僅可以很好的認(rèn)識(shí)到細(xì)胞異質(zhì)性，而且可以更好的對(duì)疾病進(jìn)行解讀。

單細(xì)胞分析技術(shù)飛速發(fā)展，這都多虧了分析工具的快速發(fā)展，如細(xì)胞分離、微流體、單細(xì)胞測(cè)序等。目前，單細(xì)胞分析的應(yīng)用已涉及多個(gè)的領(lǐng)域，包括基礎(chǔ)研究型應(yīng)用，如癌癥、免疫學(xué)、干細(xì)胞等；臨床應(yīng)用，如無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷、體外受精、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）等。

單細(xì)胞基因組旨在通過(guò)組學(xué)方法研究單個(gè)細(xì)胞。近年來(lái)隨著技術(shù)的發(fā)展，這一年輕的領(lǐng)域正在迅速成熟起來(lái)。單細(xì)胞基因組研究的前身可以追溯到用芯片檢測(cè)單細(xì)胞的基因表達(dá)。不過(guò)，新一代DNA測(cè)序才是單細(xì)胞基因組學(xué)的大功臣，這些技術(shù)的出現(xiàn)讓單細(xì)胞基因組研究最終一飛沖天。如今，單細(xì)胞RNA-seq已經(jīng)成為了成熟的日常操作，其他形式的單細(xì)胞分析開(kāi)始百花齊放，包括單細(xì)胞分離和捕獲以及單細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)、染色質(zhì)修飾等等。

1.單細(xì)胞分離和捕獲

單細(xì)胞分析的第一步是細(xì)胞捕獲和分離，單細(xì)胞的獲取，最初是通過(guò)梯度稀釋的方法，既繁瑣也容易污染；隨后通過(guò)顯微操作方法，用類似注射器的裝置分離單細(xì)胞，或激光捕獲顯微切割技術(shù)（LCM），然而可操作性并不強(qiáng)；再往后，流式細(xì)胞儀的分揀成為常用的單細(xì)胞分離方法，但對(duì)環(huán)境要求過(guò)高；近年來(lái)微流控技術(shù)的發(fā)明，逐步成為研究者們的選擇,不僅減少了昂貴試劑的使用量，節(jié)約了成本，還提高了操作效率和靈敏度。

2.單細(xì)胞DNA測(cè)序

單細(xì)胞全基因組DNA測(cè)序是一項(xiàng)富有挑戰(zhàn)性的工作，由于在單細(xì)胞中的DNA和RNA的數(shù)量非常小（一個(gè)典型的人類細(xì)胞僅含有約6.6pg DNA、10pg總RNA。）用傳統(tǒng)的測(cè)序儀無(wú)法檢測(cè)，所以科學(xué)家們必須首先對(duì)這些分子進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)盡量的減少錯(cuò)誤。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)(Single-CellSequencing)是在單細(xì)胞水平對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序的技術(shù)。目前的全基因組擴(kuò)增技術(shù)主要有三種：簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR擴(kuò)增（DOP-PCR），多重置換擴(kuò)增（MDA）；和基于多次退火和成環(huán)的擴(kuò)增循環(huán)（MALBAC）。市場(chǎng)上有很多種擴(kuò)增試劑盒，去年華大基因的研究人員在《GigaScience》發(fā)表了文章，利用7種試劑盒開(kāi)展單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增，系統(tǒng)地比較了不同WGA方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，尤其關(guān)注變異檢測(cè)。結(jié)論是: 對(duì)于那些需要低重復(fù)率和高基因組覆蓋度的研究，如疾病研究中的SNV檢測(cè)， MDA和MALBAC策略比較合適。

此外，如果同時(shí)開(kāi)展SNV和CNV檢測(cè)，他們建議使用MDA-2和/或MALBAC，因?yàn)樗鼈冊(cè)谧儺悪z測(cè)上的效率和準(zhǔn)確性更高。不過(guò)，若有大量細(xì)胞需要擴(kuò)增，成本是必須考慮的因素。MDA和DOP-PCR是常用的全基因組擴(kuò)增方法，成本相對(duì)較低。相比之下，MALBAC的成本要更高一些，且相對(duì)來(lái)說(shuō)操作更為復(fù)雜。在單細(xì)胞研究的大潮中，新的測(cè)序方法層出不窮。不過(guò)，很少有人對(duì)這些方法進(jìn)行系統(tǒng)的比對(duì)。The Scientist雜志聯(lián)系了單細(xì)胞研究領(lǐng)域的一些專家，請(qǐng)他們分享了在單細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄研究的秘訣，比較了一些常用的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。

霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所的科學(xué)家們對(duì)人類大腦皮層神經(jīng)元進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序，并根據(jù)發(fā)育過(guò)程中累積的體細(xì)胞突變重建了神經(jīng)元譜系。他們的研究顯示，正常成年人的單個(gè)大腦神經(jīng)元具有一千多個(gè)點(diǎn)突變，而且不同神經(jīng)元的突變形式并不相同。大多數(shù)突變發(fā)生在大腦發(fā)育完成之后，是基因積極活動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的。

3.單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析

單細(xì)胞基因組技術(shù)正在迅猛發(fā)展，單細(xì)胞計(jì)算分析也在奮起直追。統(tǒng)計(jì)和計(jì)算方法是單細(xì)胞基因組研究的核心，只有正確的方法才能幫助我們從數(shù)據(jù)中提取有意義的生物學(xué)信息。前不久，德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心的研究人員開(kāi)發(fā)了shouge用于單細(xì)胞DNA測(cè)序的突變檢出程序——Monovar。這一重要研究成果于發(fā)表在Nature Methods雜志上。研究人員認(rèn)為Monovar是單細(xì)胞測(cè)序評(píng)估SNV的一大進(jìn)步，能夠?yàn)槿藗兲峁┒喾N疾病的關(guān)鍵信息。精確檢測(cè)SNV對(duì)于癌癥診療、個(gè)性化醫(yī)療和產(chǎn)前診斷非常重要，而Monovar在這些方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

4.單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析

談到單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析，我們不能不提質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)（mass cytometry）。這種技術(shù)是流式細(xì)胞技術(shù)與質(zhì)譜分析技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的結(jié)晶，利用質(zhì)譜原理對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)的檢測(cè)。它繼承了傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的高速分析的特點(diǎn)，又具有質(zhì)譜檢測(cè)的高分辨能力，是流式細(xì)胞技術(shù)一個(gè)新的發(fā)展方向。質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)能在單細(xì)胞水平上同時(shí)分析超過(guò)40種細(xì)胞參數(shù)，極大的增強(qiáng)了流式細(xì)胞分析評(píng)估復(fù)雜細(xì)胞系統(tǒng)和過(guò)程的能力。Cell雜志發(fā)表的“Mass Cytometry: Single Cells, Many Features"綜述，全面介紹了質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)的現(xiàn)狀，相關(guān)儀器，主要應(yīng)用范圍，數(shù)據(jù)分析方法，以及未來(lái)的發(fā)展前景。

5.單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)分析

表觀遺傳學(xué)是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象變化等。比較通俗的講表觀遺傳學(xué)是研究在沒(méi)有細(xì)胞核DNA序列改變的情況時(shí)，基因功能的可逆的、可遺傳的改變。表觀遺傳學(xué)修飾可以在不改變DNA序列的情況下調(diào)控基因的活性，對(duì)于人類發(fā)育、人類疾病和環(huán)境影響有深遠(yuǎn)的意義。DNA甲基化是最常見(jiàn)的一種表觀遺傳學(xué)修飾，廣泛參與了細(xì)胞對(duì)基因表達(dá)的控制，在細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和疾病狀態(tài)中起到了關(guān)鍵性的作用。2014年7月，Nature Methods雜志發(fā)布了單細(xì)胞重亞硫酸鹽測(cè)序（scBS-seq）技術(shù)。該技術(shù)可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞的所有DNA甲基化進(jìn)行全基因組分析，幫助人們進(jìn)一步理解胚胎的發(fā)育機(jī)制，更好的進(jìn)行癌癥等治療。

通過(guò)單細(xì)胞分析來(lái)檢測(cè)表觀遺傳學(xué)（epigenetics）狀態(tài)是單細(xì)胞研究的一大趨勢(shì)。DNase I超敏感位點(diǎn)（DHS）是對(duì)DNaseⅠ高度敏感的活性染色質(zhì)區(qū)域。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DHS定位，能夠提供轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和染色質(zhì)狀態(tài)的重要信息，一直是科學(xué)家們的研究熱點(diǎn)。DNase測(cè)序（DNase-seq）是進(jìn)行全基因組DHS分析的常用方法，不過(guò)DNase-seq需要數(shù)百萬(wàn)細(xì)胞，大大限制了該技術(shù)的應(yīng)用范圍。美國(guó)NIH的趙可吉博士開(kāi)發(fā)了在單細(xì)胞中檢測(cè)全基因組DHS的超靈敏策略，并將其命名為單細(xì)胞DNase測(cè)序（scDNase-seq）。

總結(jié)：?jiǎn)渭?xì)胞分析技術(shù)飛速發(fā)展，但目前來(lái)看，還處在初級(jí)階段，我們相信：在單個(gè)細(xì)胞層面我們將以*的水平理解基因組學(xué)，表觀基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的多樣性，推動(dòng)基礎(chǔ)研究和臨床研究的快速發(fā)展。