單克隆抗體的純化技術(shù)操作步驟

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從培養(yǎng)液或腹腔積液獲得的單克隆抗體，不需要純化即可應(yīng)用于日常診斷或定性研究。如果用于免疫標(biāo)記測(cè)定，須分離和純化?？捎冒腼柡汀柡土蛩徜@進(jìn)行沉淀，進(jìn)行初步濃縮和純化；可用親和層析法進(jìn)一步純化。

一、腹水型單抗的純化

在單抗純化之前，一般均需對(duì)腹水進(jìn)行預(yù)處理，目的是為了進(jìn)一步除去細(xì)胞及其殘?jiān)⑿☆w粒物質(zhì)、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和過濾離心法，以前者處理效果為佳，而且操作簡(jiǎn)便。

1、二氧化硅吸附法

新鮮采集的腹水（或凍存的腹水），2000r/min 15分鐘，除去細(xì)胞成分（或凍存過程中形成的固體物質(zhì)）等；取上層清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥緩沖鹽水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀釋；然后以每10ml稀釋腹水中加150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鐘，不時(shí)搖動(dòng)；2000g離心20分鐘，脂質(zhì)等通過該法除去，即可得澄清的腹水。

2、過濾離心法

用微孔濾膜過濾腹水，以除去較大的凝塊及脂肪滴；用10000g 15分鐘高速離心（4℃）除去細(xì)胞殘?jiān)靶☆w粒物質(zhì)。

3、混合法

即上述兩法的組合，先將腹水高速離心，取上清液再用二氧化硅吸附處理。

二、單抗的粗提

1、硫酸銨沉淀法

（1）飽和硫酸銨溶液的配制

500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至*溶解，室溫過夜，析出的結(jié)晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/L NaOH調(diào)PH至7.8。

（2）鹽析

吸取10ml處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液5.0ml；繼續(xù)緩慢攪拌30分鐘；10000r/min離心15分鐘；棄去上清液，沉淀物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30分鐘，同法離心；重復(fù)前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl緩沖液中。

（3）脫鹽

常用柱層析或透析法。柱層析法是將鹽析樣品過Sephadex G-50層析柱，以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速每分鐘1ml。蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋于2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分鐘，用蒸餾水清洗透析袋內(nèi)外表面，再用蒸餾水煮透析袋10分鐘，冷至室溫即可使用（并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存?zhèn)溆茫Ⅺ}析樣品裝入透析袋中，對(duì)50-100倍體積的PBS或Tris-HCl緩沖液透析（4℃）12-24小時(shí)，其間更換5次透析液，用萘氏試劑（碘化gong11.5g，碘化鉀8g，加蒸餾水50ml，待溶解后，再加20% NaOH 50ml）檢測(cè)，直至透析外液無黃色物形成為止。

（4）蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀釋倍數(shù)；或（Pr）=OD280×稀釋倍數(shù)/1.3

（5）分裝凍存?zhèn)溆?/p>

2、辛酸-硫酸銨沉淀法

該法簡(jiǎn)單易行，適合于提純IgG1和IgG2b，但對(duì)IgG3和IgA的回收率及純化效果差。其主要步驟如下：取1份預(yù)處理過的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸緩沖液，用1mol/L HCl調(diào)PH至4.8；按每毫升稀釋腹水加11ul辛酸的比例，室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤胄了幔?0分鐘內(nèi)加完，4℃靜置2小時(shí)，取出15000g離心30分鐘，棄沉淀；上清經(jīng)尼龍篩過濾（125um），加入1/10體積的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH調(diào)PH至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45%飽和度，作用30分鐘，靜置1小時(shí)；10000g離心30分鐘，棄上清；沉淀溶于適量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，對(duì)50-100倍體積的PBS透析，4℃過夜，其間換水3次以上；取出10000g離心30分鐘，除去不溶性沉渣，測(cè)定蛋白質(zhì)含量后，分裝，凍存?zhèn)溆谩?/p>

3、優(yōu)球蛋白沉淀法

該法適用于IgG3和IgM型單抗的提取，所獲制品的抗體活性幾乎保持不變，對(duì)IgG3單抗的回收率高于90%，對(duì)IgM單抗的回收率為40-90%不等。其操作步驟如下：取一定量的預(yù)處理過的腹水，先后加入NaCl和CaCl2，使各自的濃度分別達(dá)0.2mol/L和25mmol/L，隨之可見纖維蛋白的產(chǎn)生；經(jīng)濾紙過濾后，濾液對(duì)100倍體積的去離子水透析，4℃ 8-15小時(shí)（若是IgG3單抗，也可室溫2小時(shí)），其間換水1-2次；取出后22000g離心30分鐘，棄上清；將沉淀溶于PH8.0 1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重復(fù)上述的透析與離心；將沉淀的優(yōu)球蛋白濃度調(diào)至5-10mg/ml，分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

三、單抗純化的方法

單抗純化的方法有很多種，應(yīng)根據(jù)具體單抗的特性和實(shí)驗(yàn)條件選擇適宜的方法，常用的技術(shù)有DEAE離子交換層析柱、凝膠過濾法和親和層析法三種。

1、離子交換層析：

分離蛋白質(zhì)是根據(jù)在一定pH 條件下，蛋白質(zhì)所帶電荷不同而進(jìn)行的分離方法。常用于蛋白質(zhì)分離的離子交換劑有弱酸型的羧甲基纖維素(CM纖維素) 和弱堿型的二乙基氨基乙基纖維素(DEAE纖維素)。前者為陽離子交換劑，后者為陰離子交換劑。

離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負(fù)電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。由于蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來

2、凝膠過濾法：

一定型號(hào)的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外。洗脫時(shí)，大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小，小分子則在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長(zhǎng)，后洗脫下來，洗脫體積大。

缺點(diǎn)：從凝膠過濾的原理可知，蛋白質(zhì)分子通過凝膠柱的速度(即洗脫體積的大小)并不直接取決于分子的質(zhì)量，而是它的斯篤克半徑，利用凝膠過濾法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(已知分子量和斯篤克半徑)和待測(cè)蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀(接近球體)，否則不能得到比較準(zhǔn)確的分子量。分子形狀為線形的或與凝膠能發(fā)生吸附作用的蛋白質(zhì)，則不能用此方法測(cè)定分子量。而且柱子成本比較高，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程耗時(shí)很長(zhǎng)。

3、免疫親和層析法：

是利用生物體內(nèi)存在的抗原、抗體之間高度特異性的親和力進(jìn)行分離的方法。親和層析的應(yīng)用主要是生物大分子的分離、純化。利用抗原、抗體之間高特異的親和力而進(jìn)行分離的方法又稱為免疫親和層析。例如將抗原結(jié)合于親和層析基質(zhì)上，就可以從血清中分離其對(duì)應(yīng)的抗體。在蛋白質(zhì)工程菌發(fā)酵液中所需蛋白質(zhì)的濃度通常較低。

用離子交換、凝膠過濾等方法都難于進(jìn)行分離，而親和層析法則是一種非常有效的方法。將所需蛋白質(zhì)作為抗原，經(jīng)動(dòng)物免疫后制備抗體，將抗體與適當(dāng)基質(zhì)偶聯(lián)形成親和吸附劑，就可以對(duì)發(fā)酵液中的所需蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。