原位雜交ISH 整體實驗方案

艾柏森（北京）生物科技有限公司

原理簡介：

　原位雜交技術（in situhybridization）是以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異核酸分子的技術。使含有特異序列、經過標記的核酸單鏈即探針，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

可以檢測cRNA、miRNA、LnRNA、DNA。可以各種種屬的標本，包括哺乳動物、爬行動物、菌、植物標本。也可以檢測組織芯片。

注：為了提高檢測的成功率，請在取材前跟公司業務員聯系，確認取材、固定、包埋要注意的事項。

樣品保存：
RNA 保存：
RNase 酶的存在使 RNA 保存變得困難。此酶廣泛存在于玻璃器皿上、試劑中以及操作人員身上及衣服上。RNase 可迅速破壞細胞中的 RNA 及 RNA 探針本身，因此用戶的實驗過程、手套和溶液需要保證無菌，防止探針或組織 RNA 受到 RNase 的污染。

冷凍切片的一般樣品保存：
為了使保存的載片獲得好的結果，請勿將載片在室溫環境下干燥保存。正確方法是，將其置于 100% 乙醇中-20 °C 保存，或將其用莎倫包裝膜覆蓋的塑料盒在 -20 °C 或 -80 °C條件下保存。這種保存方法可使載片保存數年。

探針選擇：

RNA 探針：

RNA 探針長約 250–1500bp；長度為800bp左右的探針具有較好的靈敏度和特異性。轉錄模板應支持探針（反義鏈）和陰性對照（正義鏈）RNA 的轉錄。將轉錄模板克隆至包含對生啟動子的載體可實現這一目的。制備探針之前，必須對環狀模板進行線性化，但也可使用 PCR 模板。

DNA 探針：

DNA 探針為原位雜交提供較高的靈敏度。與RNA探針相比，DNA探針與靶mRNA 分子的雜交強度較弱，因此在雜交后的洗滌中不應使用甲醛。

探針特異性至關重要。如果已知細胞中mRNA或DNA的確切核苷酸序列，則可據此設計高度精確的互補探針。如果超過 5% 的堿基對不互補，那么探針只能與靶序列發生輕度雜交。這意味著，探針更容易在洗滌和檢測步驟中被洗去，可能無法正確檢測。

實驗方案舉例：
(DIG)標記RNA探針原位雜交實驗方案

此方案介紹了如何使用DIG標記的RNA單鏈探針來檢測石蠟包埋切片中目標基因的表達情況。

1) 脫蠟

如為冷凍切片請從第 2 步開始操作。

如為甲醛固定的石蠟包埋切片，請繼續此步驟。

首先，對載片進行脫蠟和復水操作。如果石蠟去除不*，則會導致切片的染色效果較差。

將載片置于支架上，然后執行以下洗滌操作：

二甲苯：2x3 分鐘

1:1 的二甲苯和100%乙醇：3 分鐘

100%乙醇：2x3 分鐘

95%乙醇：3 分鐘

70%乙醇：3 分鐘

50%乙醇：3 分鐘

使用冰冷的自來水清洗

抗原修復步驟之前將載片置于自來水中。從這一步開始，不能使載片干燥，因為干燥會導致非特異性抗體結合和高背景染色。

2) 抗原修復

將含20 µg/mL蛋白酶K的50mM Tris預熱并在37 °C條件下孵育酶解10–20分鐘。孵育時間和蛋白酶 K 的濃度可能需要根據實際情況優化。

我們建議通過蛋白酶 K 滴定實驗來確定合適條件。酶解不充分會導致雜交信號降低，過度酶解會影響組織形態，給雜交信號的定位帶來極大困難。蛋白酶 K 的*濃度會隨組織類型、固定時間和組織大小而發生變化。

3) 使用蒸餾水清洗載片5次。
4) 將載片浸入預冷的20% (v/v) 乙酸中20秒。這樣可使細胞通透化，使探針或抗體能夠透過。
5) 分別使用70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇洗滌載片（每次約1分鐘）使其脫水，然后風干。
6) 向每個載片中加入 100 µL 雜交液。

鹽溶液 (20x)

4 M NaCl

100 mM EDTA

200 mM Tris-HCl pH 7.5

100 mM NaH2PO4.2H2O

100 mM NaH2PO4.2H2O

丹哈德溶液 (100x)

10 g聚蔗糖

10 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮）

10 g 牛血清白蛋白 (BSA)

500 ml無菌 dH2O

7) 將載片置于所需雜交溫度下的增濕雜交盒中孵育1 小時。雜交溫度的范圍通常為 55–62 °C。
8) 在PCR 管中用雜交液稀釋探針。利用PCR儀在95 °C條件下加熱RNA 或DNA 2分鐘，使其變性。然后立即將探針置于冰上冷卻，以防止重退火。
9) 除去雜交液。向每個切片加入50–100μl探針稀釋液，覆蓋整個樣品。在 65 °C 條件下在增濕的雜交盒中孵育過夜。用蓋玻片蓋住樣品，以防樣品蒸發。

在此步驟中，RNA 探針會與相應的mRNA雜交，或DNA探針會與相應的細胞DNA雜交。雜交溫度的優化取決于所用的探針序列以及細胞或組織類型。所分析的每種組織類型都需進行雜交溫度的優化。

探針的*雜交溫度取決于靶序列中堿基的百分比含量。序列中胞嘧啶和鳥嘌呤的比例是關鍵因素。

10) 嚴格洗滌

通過調節溫度、鹽濃度和洗滌劑濃度等溶液參數可消除非特異性相互作用。

配制 1 L 20x 檸檬酸鈉緩沖液 (SSC)

175.3 g 氯化鈉 (3 M)

88.2 g 檸檬酸鈉

800 mL 無菌水

使用檸檬酸將 pH 調節為5，定容至1 L 并使用高壓滅菌器進行滅菌處理
洗滌 1

50% 甲酰胺的 2x SSC

3x5 分鐘，37-45 ℃

在較高溫度（高達 65° C）下短時間洗滌，洗去多余的探針和雜交緩沖液。如果洗滌時間過長，則會洗掉大量的雜交探針 RNA/DNA。

洗滌 2

  0.1–2x SSC

  3x5 分鐘，25-75 ℃

此步驟會消除非特異性和/或重復性 DNA/RNA 雜交。

按照以下說明對嚴謹洗滌的溫度和鹽濃度進行優化：

· 對于極短的DNA/RNA 探針 (0.5–3 kb) 或極為復雜的探針，洗滌溫度應更低（上限45 °C）且嚴格度更弱 (1–2xSSC)。

· 對于單基因座或較大的探針，溫度應在65 °C 左右且嚴格度應較強（低于0.5x SSC）。

· 對于重復性探針，溫度應達到上限且嚴格度應達到大（例如 α-衛星重復序列）。

11) 在室溫下使用 MABT（含 Tween20 的馬來酸緩沖液）洗滌兩次，每次30分鐘。MABT 的性質比PBS 更溫和，更適用于核酸檢測。

配制 5x MABT 母液

   58 g 馬來酸

   43.5 g NaCl

   55 g Tween-20

   900 mL 水

添加三羥甲基氨基甲烷，將 pH 調節至 7.5。大約需要 100 g 三羥甲基氨基甲烷。定容至 1 L。

12) 烘干載片。
13) 將其轉移至增濕盒中，向每個切片加入 200 µL 封閉緩沖液（MABT + 2% BSA，牛奶或血清）。在室溫下封閉 1–2 小時。
14) 去除封閉緩沖液。將抗標記抗體以所需稀釋度加入封閉緩沖液。查看抗體說明書中推薦的濃度/稀釋度。在室溫下孵育 1–2 小時。
15) 在室溫下使用 MABT 洗滌載片 5 次，每次 10 分鐘。
16) 在室溫下使用預染色緩沖液（100 mM Tris pH9.5，100 mM NaCl，10 mM MgCl2）洗滌載片 2 次，每次 10 分鐘。
17) 如需進行熒光檢測，請跳至第 18 步。對于其他形式的檢測，請將載片放回增濕盒中，然后依照廠家說明書(如有說明書的話)使其顯色。

18) 使用蒸餾水清洗載片。
19) 將載片風干 30 分鐘。然后使用 100% 乙醇進行洗滌，并將其*風干。
20) 使用 DePeX 封片溶液進行封片。